目前對(duì)奶粉中脂溶性維生素A、D3、E測(cè)定的前處理方法多采用皂化方法去除脂肪[1-7]，皂化過(guò)程后使用大量的有機(jī)溶劑進(jìn)行液液萃取以洗除雜質(zhì)，操作步驟復(fù)雜，維生素D3樣品還需經(jīng)硅膠柱做進(jìn)一步的凈化才能進(jìn)行檢測(cè)，造成實(shí)驗(yàn)時(shí)間成本的增加，不利于大批量樣品的檢測(cè)。本文研究了利用固相萃取法作為奶粉樣品的前處理方法，液相色譜法作為檢測(cè)手段，實(shí)現(xiàn)同時(shí)測(cè)定奶粉中維生素A、D3、E的含量，該方法可簡(jiǎn)化奶粉樣品的前處理過(guò)程，節(jié)省有機(jī)溶劑的使用，操作簡(jiǎn)便。

1. 樣品處理

皂化提取：2g奶粉加入1mL水混勻，加入1 mL VC/乙醇溶液破壁處理，混勻，加入10mL氫氧化鉀堿液（1.25g/mL），55℃條件下，水浴皂化45min，取出冷卻至室溫，向皂化液中加入適量無(wú)水乙醇，使之含50%乙醇，6000r/min離心5min后，取上清液，用1至2個(gè)微孔過(guò)濾器對(duì)其進(jìn)行過(guò)濾，至Qdaura 卓睿™全自動(dòng)固相萃取儀上樣管中作為待凈化液。

2. 固相萃取凈化

Qdaura^TM卓睿全自動(dòng)固相萃取儀程序設(shè)定：5mL甲醇，和5mL水活化，加樣，10mL50%乙醇/水淋洗，抽干20min。2mL 丙酮，10mL乙酸乙酯洗脫，收集。收集液于40℃氮?dú)獯蹈桑?/SPAN>1mL甲醇定容，0.45um PTFE過(guò)濾器過(guò)濾，準(zhǔn)備進(jìn)液相色譜分析。

3. 色譜條件

液相色譜儀：LC-10F

色譜柱：Venusil MP C18，4.6 mm *150 mm，5µm；

流動(dòng)相：甲醇；

流速：1mL/min；

柱溫：30℃；

進(jìn)樣量：20µL；

波長(zhǎng)變化見(jiàn)表1：

表1 波長(zhǎng)變化梯度表

4. 結(jié)果與討論

圖1 低濃度維生素標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

從左至右依次為：維生素A（5.0µg/mL）、維生素D3（9.8µg/mL）、維生素E（99µg/mL）

4.1 工作曲線及檢出限

根據(jù)儀器對(duì)各個(gè)物質(zhì)的響應(yīng)情況，將維生素A、D3、E分別由儲(chǔ)備液用正己烷逐級(jí)稀釋?zhuān)飨♂尦?個(gè)濃度，維生素A濃度范圍為0.25µg/mL~25µg/mL，維生素D3濃度范圍為0.30µg/mL~30µg/mL，維生素E濃度范圍為2.5µg/mL~250µg/mL，將溶液進(jìn)HPLC進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算出檢出限，回歸方程及檢出限見(jiàn)表2。可見(jiàn)，液相色譜儀對(duì)維生素A、D3、E的響應(yīng)與濃度呈良好的線性關(guān)系。

表2 線性回歸方程及檢出限

圖2 皂化-固相萃取法色譜圖

4.2 皂化-固相萃取和傳統(tǒng)皂化-液液萃取法的實(shí)驗(yàn)效果對(duì)比

傳統(tǒng)皂化-液液萃取法參考《GB 5413.9—2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中維生素A、D、E 的測(cè)定》的樣品前處理2個(gè)奶粉（每個(gè)樣稱(chēng)取2g）的平行樣，作為參照。同時(shí)以皂化固相萃取法做兩個(gè)平行樣品。

表3 傳統(tǒng)皂化-液液萃取法與皂化固相萃取法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比

由于選用的奶粉VD含量較低，沒(méi)有檢出。

從上述對(duì)比可以看出，皂化固相萃取法相比國(guó)標(biāo)的皂化液液萃取法具有簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)萃取效果更好。*的缺點(diǎn)是出峰靠前的維生素A附近有較多的弱保留物質(zhì)的干擾，但是依靠MP C18的強(qiáng)大的分離能力，可以實(shí)現(xiàn)分離維生素A和干擾物質(zhì)的基線分離。同時(shí)這些弱保留的物質(zhì)很容易被洗脫出色譜柱，所以不會(huì)對(duì)色譜柱造成較大的污染。

4.2.3加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

表4 加標(biāo)回收率及精密度

4.2.3 實(shí)際樣品檢測(cè)

根據(jù)所建立的方法分析了從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)的3種品牌奶粉，分別編號(hào)為1號(hào)、2號(hào)和3號(hào)按照上述方法進(jìn)行樣品處理和檢測(cè)，所得維生素A、D3和E的含量結(jié)果見(jiàn)表6。

圖7. 2號(hào)奶粉樣品色譜圖

表6 奶粉中維生素含量（µg/g）

4.3 結(jié)論

采用改進(jìn)后的皂化-固相萃取方法來(lái)替代傳統(tǒng)的皂化法來(lái)測(cè)定奶粉中維生素含量，皂化能充分提取出奶粉中維生素A，D，E，再經(jīng)過(guò)Cleanert Vitamin固相萃取柱進(jìn)行凈化吸附洗脫，既避免了傳統(tǒng)皂化中液液萃取中有機(jī)溶劑的大量使用，也簡(jiǎn)化了操作步驟，同時(shí)能滿足一般奶粉樣品的含量分析要求。

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